|原创：小鱼儿

以16S为代表的meta 扩增子测序分析，由于极高的性价比而在微生物领域广泛应用。

相对于其他微生物群落分析，扩增子成本又低，可以开展的分析内容还非常多，比如我们的Omicsmart平台上，就已经有100多分析点。

因此，meta 扩增子测序分析是大家入门微生物群落分析、初步开展微生物作用机制的首选组学方法。

但是，一个微生物基因组的大小可能有几Mb，甚至几百Mb，仅仅基于400bp左右的片段进行分析，其研究局限性可想而知。那么16S和宏基因组二者到底有何具体的异同，我们如何选择，才能获得更好的结果呢？

今天，我们通过两组学的深入对比，为大家汇总关于16S和宏基因组的微生物群落分析策略。

1.组学初步对比

初步来看（图1），像α/β多样性、物种等的基础分析，二者是相近的。但是扩增子的分析更为基础通用，而宏基因组可挖掘探索的分析空间更大，因而分析难度、复杂度更高，对应的，收获更高水平文章的概率也会更高。从图1 也可以看出，16S和宏基因组都涉及了微生物最核心的两类要素——物种和功能。我们以同时进行了16S和宏基因组测序的15个水体样本为例，对比讨论两组学结果的差异特征。

图1 组学初步对比

2.组学基础分析对比

2.1物种篇

第一回合：物种数量对比

首先，我们对比两组学物种（仅考虑细菌和古菌）的数量情况。“属”作为最接近生态功能分类的水平，在物种分析中有着极高的关注度。在不考虑丰度的情况下，如图2，两组学都检测到的物种有180个，16S特有的仅有75个，宏基因组特有的2994个。而这一差距在“种”水平上更大。可见，由于引物扩增、序列太短等大大限制了物种的鉴定范围。

而宏基因组未检测到的部分，可能是由测序深度影响，但影响极其有限。

图2 “属”水平对比

如果仅考虑丰度高于1%的各水平物种，如图3。

总体来看，共有物种（蓝色区域）29个。宏基因组特有29个，16S特有16个。其中共有层级主要集中在近圆心端，特有物种主要分布于分枝末端。结果表明，两组学各自的局限性仍然存在，且研究层级越精细（如属、种水平），16S的局限性越大。而由于测序成本的下降，测序量对宏基因组的限制也会逐渐减小。

图3 高丰度物种对比

第二回合：物种丰度对比（pearson）

如果说物种数量上的差异，主要影响我们研究的精细度（物种分类层级），那么物种丰度上的差异，则主要影响我们对样本规律的探讨，因为我们需要通过物种的丰度变化，找到分组间的差异，进而揭示微生物的驱动响应机制。

如图4，考虑所有物种，在门水平，两组学的一致性可达0.7。但在属水平，考虑所有物种时，相关性仅为0.2，虽然增加丰度过滤的阈值会提高相关性，但整体差异依然较大。

图4 组学pearson相关性（所有物种）

（图中点表示一个样本中的一个物种，点颜色表示物种，相同颜色的不同点是某物种在所有样本中的分布）

由此说明，在大的物种分类上，或者对于高丰度的物种（靠近图4右上角的物种），两组学对规律的呈现比较一致，同时也从侧面说明两组学分析的科学性和可靠性。

但在更精细的物种层级，结果会存在一定的差异。

第三回合：样本间规律呈现

那么综合物种多样性和物种丰度两个层面，即菌群结构层面（beta多样性），两组学反应的规律一致性如何呢？我们以Bray距离的Mantel test为例，即使在属水平，两组学依然有很高的显著相关性，达0.688（图5）。这就说明，虽然在精细的分类上，两组学物种数量和丰度存在较大差异，但最终反映出的样本规律是一致的，即由各自组学获得的菌群结构差异一致，比如都可以说明分组（时空差异、实验处理）对群落结构造成的影响。

图5 两组学mantel test相关性分析

2.2 功能篇

因为16S基于Tax4Run或者PICRUSt也可以获得功能分析结果，我们以PICRUSt2软件的Pathway结果为例，对比其与宏基因组结果的特征。如图6，与物种数量的规律相反，16S鉴定到的功能分类反而更多，不过数量上的差异程度远小于物种。

但整体分布规律上，二者还是比较接近，pearson相关性达0.63。除去宏基因组测序量偏低的影响，更主要的原因在于16S的功能预测可能存在一定的高估，对于更为精细的功能研究来说，准确度不够。

图6 两组学功能对比（pathway）

3.应用策略

基于以上对比分析，我们发现，16S属于“麻雀虽小，五脏俱全”型，虽然测序分析的片段短，但是多样性分析、物种、功能分析都不耽搁。

宏基因组属于“博而可以精”型（即假定测序深度满足基本需求），对物种和功能都有比较丰富的反映。

此外，宏基因组测序真实获得了各类型物种/功能的序列，所以可以基于海量序列开展专属于宏基因组的分析，比如binning分析、CAG分析、基因序列进化树分析等。这些高级复杂分析点对提升文章深度也有重要推进作用。

那么，对于这两种组学，我们如何抉择呢？

综合分析结果和成本差异，如果是初步接触微生物群落或者经费有限，可以先分析16S，然后基于16S的参考和指导，精挑样本，再把宏基因组当作跳板，将研究深度扩展到更精细的物种（种）和功能层面。既提高的了文章深度，又更为经济可行。比如基于大批量的16S测序分析，挑选关键样本开展宏基因组的深入分析，进而提升研究深度，如链接中自闭症文章的应用（文章链接）。

如果已经有微生物分析经验，则可以进入宏基因组领域，在海量数据上进行更复杂深入的探讨。同时，由于宏基因组的分析准确度会受测序量的影响，因此我们可以结合16S数据作为宏基因组组学分析可靠性的验证，即对所有样本同时开展16S与宏基因组的测序分析。关于16S与宏基因组互相验证的思路和示例，我们将在后续文章中继续分享。